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点击下载该文件 日期:2021/7/26 10:30:10
产品简介:
葡萄糖不仅是细胞能量代谢的主要底物,而且其代谢中间产物是生物合成的重要底物。植物可
通过光合作用产生葡萄糖。就哺乳动物而言,葡萄糖不仅是大脑神经系统、肌肉、脂肪组织等的唯一能源,而且与还原性辅酶、乳糖和乳脂的合成密切相关。
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并产生过氧化氢;过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-
氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。
试验中所需的仪器和试剂:
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵和蒸馏水。
试剂一:葡萄糖 9mg×1支,4℃保存;临用前加入1ml蒸馏水充分溶解为50μmol/mL 葡萄糖溶液, 用蒸馏水稀释为 0.5μmol/mL 葡萄糖溶液-20℃ 保存;
试剂二:液体 25mL×1 瓶,4℃保存; 试剂三:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;
混合试剂的配制:使用前将试剂二和试剂三 1:1 等体积混合,用多少配多少。
一、葡萄糖提取:
1、组织的处理:称取约 0.1g 样本,加入 1mL 蒸馏水研磨成匀浆,置沸水浴中煮沸 10 分钟(盖紧,防止水分散失),冷却后,8000g,常温离心 10min,取上清液备用。
2、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):蒸馏水体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏水), 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复 30 次),置沸水浴中煮沸 10 分钟(盖紧,防止水分散失),冷却后,8000g,25℃离心 10min,取上清液备用。
1、分光光度计预热 30min。波长调至 505nm,蒸馏水调零。
2、在 1.5mL 离心管中依次加入下列试剂:
试剂(μL) | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
样本 |
|
| 100 |
试剂一 |
| 100 |
|
蒸馏水 | 100 |
|
|
混合试剂 | 900 | 900 | 900 |
混匀,置 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中,保温 15min,于 505nm 波长处读取吸光度。
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1、按蛋白浓度计算
葡萄糖含量(µmol/mg prot)=C ×(A 测定管-A 空白管)÷(A标准管-A 空白管)×V 样÷(Cpr×V
样)
=0.5×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算
葡萄糖含量(µmol/g 鲜重)=C ×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ×V 样÷(W÷V
样总×V 样)
=0.5 ×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W
3、按细菌或细胞数量计算
葡萄糖含量(µmol/104 cell)=C ×(A 测定管-A 空白管)÷(A标准管-A 空白管) ×V 样÷(500÷V
样总×V 样)
=0.001 ×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)
C:葡萄糖溶液浓度,0.5µmol/mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样:加入的样本体积,
100µL=0.1mL;V 样总:样本总体积,1mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞数量,500 万。
4、若 A 测定管大于 1.5,稀释后进行实验。