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点击次数:6788 日期:2021/6/21 14:46:46
超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒
货号:H0142
规格:50T/48S
注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
产品内容:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体32mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体25mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体25mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂四:氯仿,自备。
亚硝酸钠标准品:液体1mL×1支,4℃保存。10μmol/mL亚硝酸钠。
产品说明:
生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用,但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用,导致机体细胞和组织代谢异常,从而引起多种疾病。
超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO2-,NO2-在对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下,生成红色的偶氮化合物,在530nm有特征吸收峰,根据A530值可以计算样品中O2-含量。
自备实验用品及仪器:天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。
操作步骤:
一、超氧阴离子提取
1.植物、动物组织:称取约0.1g样本,加入提取液1mL,充分研磨,12000rpm,4℃,离心20min,取20μL上清测定蛋白含量,其余上清作为待测样本。
2.血清或培养液:直接测定
二、测定操作表
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至530nm,蒸馏水调零。
2、标准溶液的制备
称取适量亚硝酸钠标准液,首先16倍稀释至 0.625µmol/mL,然后进行倍比稀释至 0.3125、0.15625、 0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.0049、0.00244、0.0012、0.0006µmol/mL 梯度稀释的标准溶液, 用0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.00244、0.0006µmol/mL 标准管做标准曲线。
3、操作表
| 空白管 | 测定管 | 标准管 |
标准溶液(mL) |
|
| 0.2 |
样本(mL) |
| 0.2 |
|
提取液(mL) | 0.5 | 0.3 | 0.3 |
试剂一(mL) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
混匀,37℃水浴20min | |||
试剂二(mL) | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
试剂三(mL) | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
混匀,37℃水浴 20min | |||
试剂四(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混匀,8000rpm,25℃,离心 5min,小心吸取上层水相 1mL,蒸馏水调零, 1mL 玻璃比色皿,测定 A530。计算∆A 标准=A 标准管-A 空白管,∆A 样品=A 测定管-A 空白管。每次实验空白管仅需做一管。 |
三、超氧阴离子含量计算公式
1.标准曲线的绘制
以∆A 标准为 y 轴,标准溶液浓度为 x 轴,绘制标准曲线 y=kx+b。
2.超氧阴离子含量的计算
将∆A 样品带入方程得到 x 值(µmol/mL)
(1) 按照样本鲜重计算
超氧阴离子含量(µmol/g鲜重)= 2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)=2x÷W。
超氧阴离子产生速率(µmol/ min/g鲜重)= 2x×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W)÷T=0.1x÷W。
(2) 按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量(µmol/min/mg prot)= 2x×V 样本÷(V样本×Cpr)=2x÷Cpr。
超氧阴离子产生速率(µmol/min/mg prot)= 2x×V样本÷(V 样本×Cpr)÷T=0.1x÷Cpr。
(3) 按照血清或培养液体积计算
超氧阴离子含量(µmol/mL)= 2x
超氧阴离子产生速率(µmol/min/mL)= 2x÷T=0.1x。
V 样本:参与反应样本体积,0.2mL;V提取:提取过程中加入的提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品鲜重,g;T:反应时间,20min。
超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒注意事项:
1、OD值大于1.0,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、样品制备好之后,立刻进行测定,请勿将样品进行长时间的低温保存,以免影响测定结果。
3、试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。
原创作者:青岛捷世康生物科技有限公司