PCR扩增实验中经常出现的问题及解决办法

    在进行PCR扩增时，京城会遇到一些问题，需要改变各种影响PCR扩增的参数及条件，以改善反应产物的常量和特异性。

1、没有得到所希望的PCR扩增产物。

       ①确定是加入酶，检查酶是否具有活性。

       ②DNA分子解链是否充分、完全。

       ③加入的人工合成引物是否争取。

       ④在未加入Taq DNA聚合酶之前，将反映系统放置在95℃保温5-10分钟，以使蛋

         白酶及核酸酶失去活性

2、PCR扩增产物在凝胶电泳中呈片状。

   ①减少Taq DNA聚合酶的浓度。

   ②增加退火的温度

   ③降低Mg++的浓度。

   ④减少扩增循环周期次数。

   ⑤减少退火及延伸的时间。

   ⑥从凝胶中回收与所希望的DNA片段大小相同的DNA,再次进行PCR扩增。

3、凝胶电泳中出现引物二聚体区带

   ①检查引物的3`-端是否互补。

   ②设计较长的引物。

   ③增加靶目标DNA的量。

   ④降低引物的浓度。

   ⑤减少扩增循环周期次。

   ⑥增加退火的温度

4、PCR扩增产物特异性不够

   ①增加退火的温度。

   ②减少退火及延伸时间。

   ③降低引物和Taq  DNA聚合酶的浓度。

  ④改变Mg++的浓度

预防PCR扩增中污染的措施：

  1、扩增所用的试验要少量分装保存，最好为一次实验的使用。

  2、实验中实验人员要穿工作服、戴手套，尤其是RT-PCR扩增的过程中必须戴手套。

  3、实验中加取标本和反应试剂要迅速、准确、尽量减少标本取样的次数，并就近操作，避免远距离一样，阳性对照最后加入。

  4、PCR扩增实验中所使用的器械要专用，不可窜用。

  5、实验中使用的加样头，标本处理和扩增用的离心管要高压灭菌消毒。

  6、加权样本和扩增产物时，不要反复抽吸和空吸，避免产生气溶胶，污染实验室。

  7、要严格执行先加入反映实际，后加入标本DNA。

  8、扩增过程中的流程要有次序，避免已经入下步骤的扩增标本，返回到前一步骤，造成污染。

PCR扩增过程中污染的主要来源

核算扩增是一项很有效的技术，但同时优势很灵敏的方法以至于很容易出现假阳性的反应，这种假阳性反应的干扰主要产生于3个方面

  1、应用DNA质粒作为核算扩增反应的阳性对照。

  2、DNA由林勇标本，培养物或由被污染的试剂延续下来。

  3、扩增DNA的污染（即PCR产物）。

PCR扩增产物污染的主要排出方法：

补骨脂类：

补骨脂类过去主要用于治疗牛皮癣。其可悲紫外线火花并嵌入DNA分子中，抑制碱基配对。

补骨脂类从反应开始既包含于PCR混合物在热循环液中，扩增之后未打开的反应关用紫外线处理之。这种处理使补骨脂素嵌入新行程DNA分子中，并破坏了被处理的DNA重新扩增的可能性。但有一个缺点是增加补骨脂素的量影响DNA在琼脂糖凝胶中涌动以致给出一个比预期要高的分子量，还有，补骨脂素处理过的DNA嵌入溴化乙锭不如未处理的DNA好。以致染色减弱，然而以内探针所取得的杂交限号则似因补骨脂素的处理二周明显的影响。

高浓度的补骨脂素可以轻度以致PCR扩增反应，加入10%甘油能够克服这个问题。