融合蛋白的酶解和化学裂解方法
由于融合表达系统表达量较高，能够促进目的的蛋白的折叠和溶解性，并且纯化方法简便，越来越多的人选择用融合表达系统在大肠杆菌中表达目的的基因。蛋白融合表达后，根据实验目的，有时需要将目的蛋白从融合蛋白上切割下来。本部分主要介绍融合蛋白中运载蛋白的裂解方法
化学裂解法
化学裂解法操作简单、便宜、有效、甚至可以再变性的条件下裂解非变性情况下不能溶解的蛋白。其缺点在于有时目的蛋白中可能存在裂解位点，并且容易发生副反应对蛋白进行修饰。
溴化氢化学裂解法：溴化氢裂解蛋白的反应在极低PH的条件下进行。裂解发生在甲硫氨酸的C末端。虽然裂解效率高，但常发生侧链的修饰及非特异性裂解
进行预实验确定最短温育时间：取50ul冻干的蛋白2份，其中一份重悬于50ul50mg/ml溴化氢/70%甲酸中，另一份重悬于50ul70%甲酸中，室温下孵育。在0,4,8,16,24及48h分别取8ul样品冻干。
样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min用SDS-PAGE电泳分析裂解效果，找出最短温育时间。
按比例扩大反应体积，用最短温育时间进行融合蛋白裂解
注意：1溴化氢有剧毒，实验需要在通风橱中操作。2 可以用6mol/L盐酸胍/0.2mol/L盐酸代替70%甲酸进行反应，尤其是当蛋白对溴化氢有抗性或者蛋白为不溶性融合蛋白时。
羟胺化学裂解法：羟氨裂解蛋白中的天冬氨酸-甘氨酸间肽键。羟氨裂解法快速、经济、并且可以在变性的条件下裂解蛋白。需要注意的是该方法裂解通常是不完全的。
进行预实验确定最短文娱时间：取50ul冻干蛋白样品，重悬于20mmol/LTris-HCL(PH=8.0)中，与2X羟氨裂解缓冲液（4mol/L羟氨，0.4mol/L CHES缓冲液，NaOH调节PH=905，需新鲜配制）等体积混合，45℃孵育。在0,4,8,16,24及48h分别取8ul样品。
样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min用SDS-PAGE电泳分析裂解效果，找出最短温育时间。
按比例扩大反应体积，用最短温育时间进行融合蛋白裂解
注意：1 当蛋白对溴化氢有抗性或者蛋白为不溶性融合蛋白时，可以再反应中加入6mol/L盐酸胍。2 当蛋白对溴化氢有抗性时，可以将羟氨终浓度提高到3mol/L.
低PH裂解法：在酸性条件下(PH=2.5),天冬氨酸-脯氨酸之间的肽键不稳定。在37-40℃的温度条件下酸性环境可以使肽键断裂，但是酸性环境可能会导致蛋白的变性和修饰。
进行预实验确定最佳水解条件：准备下述4个反应体系在37℃条件下温育
A：20ug蛋白溶解在70%甲酸中：
B:20ug蛋白溶解在70%甲酸/6mol/L盐酸胍中
C:20ug/蛋白溶解在13%乙酸中
D：20ug蛋白溶解在13%乙酸/6mol./L盐酸胍中。
在0,12,24,48及72h分别8ul样品，用0.1mol/L Tris碱中和后，加入SDS-PAGE上杨缓冲液，100℃5min用SDS-PAGE电泳分析裂解效果，找出最短温育时间和最佳温育条件
按比例扩大反应体积，进行融合蛋白裂解。
与化学裂解法比较，溶解的方法反应条件吻合，而且实际应用的蛋白酶具有高度的特异性，有较长的底物识别序列（如凝血酶为6个氨基酸），在目的蛋白内一般没有其酶切位点存在。缺点在于酶的来源和纯度。比如大部分公司提供的肠激酶都不是很纯，可能污染有胰蛋白酶或其他物质，可能造成蛋白的讲解，因此，一般最好采用Sigma或Invitrogen公司的相关产品
1 凝血酶酶解法：凝血酶在精氨酸和赖氨酸残鸡后酶解蛋白。其最佳裂解氨基酸序列为疏水性氨基酸-疏水性氨基酸-精氨酸-赖氨酸-非酸性氨基酸-非酸性氨基酸。 预实验确定最佳酶解条件： 取30ul蛋白溶液[悬于50mol/L Tris-HCL(ph=7.5)中，终浓度1mg/ml]，加入1u凝血酶，室温下孵育。
在0,1,2,4及6h分别取5ul样品，加入SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，用SES-PSGE电泳分析酶解效果，找出最佳温育条件
按比例扩大反应体积，进行融合蛋白裂解。
肠激酶裂解法：肠激酶的酶解位点为(Asp)4-Lys序列，其反应条件范围款，可以再温度4-45℃，PH4.5-9.5之间发挥作用，
预实验确定最佳酶解条件：取15ul蛋白溶液[悬于50mol/L Tris-HCL（ph=7.5）中终浓度1mg/ml]5份，分别加入0.2,0.5,1.2u的肠激酶，37℃孵育12h
取5ul样品加入SDS-PAGE上杨缓冲液，100℃煮沸5min，用SDS-PAGE电泳分析酶解效果，找出最佳温育条件
按比例扩大反应体积，进行融合蛋白裂解
逐一：如果蛋白发生讲解，可尝试加入适量5mmol/L EDTA.\
Xa因子酶解法：Aa因子在四肽（异亮氨酸-谷氨酸/天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸）的羟基端进行切割，但是如果精氨酸序列后为精氨酸或者脯氨酸的话，Xa因子就不能酶解该蛋白。 预实验确定最佳酶解条件：取20ul蛋白溶液[悬于50mol/l Tris-HCL(ph=7.5)中，终浓度1mg/ml]计入酶（终浓度10ug/ml）室温下孵育。
在2，4,8及16h分别5ul样品，加入SDS-PAGE上杨缓冲液，100℃煮沸5min，用SDS-PAGE电泳分析酶效果找出最佳温育条件。、
按比例扩大反应体积，进行融合蛋白裂解。
注意：如果融合蛋白对Xa因子有抗性，把蛋白经过变性在复性的处理后可能会消除蛋白的抗性。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
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