高效液相色谱法的应用

 高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法(HPLC)因具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，并且随着一系列衍生化方法的开发使用，尤其对非挥发性物质，其应用以越来越广。与经典的液相色谱相比它具有以下优点：

（一）速度快

通常分析一个样品需要15-20分钟，有些样品甚至在5分钟之内即可完成一次分析。

（二）分辨率高

可选择固定相和流动相已达到最佳分离效果。

（三）灵敏度高

可采用不同的检测器已达到所需灵敏度要求。通常紫外检测器可达到10g，荧光和化学检测器可达10g。

（四）

用一根色谱柱可分离不同的化合物，使用后珠子也可能变坏，这取决于样品的类型、溶剂的性质和操作的情况。

（五）样品容易回收

样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

用高效液相色谱法（HPLC）对样品进行分析之前，首先必须建立适合该样品分析的方法；即依据样品的来源、性质、进行适当的处理后，选择合适的色谱柱和流动相及检测器对样品进行分析。

1、样品的性质 样品中待测组分的分子量大小、化学结构、溶解性等化学、物理性质决定着色谱分离类型的选择。对样品的性质分析是建立方法的前提。

若样品组成缝份简单时，可直接进行分析，只要待测组分可与其他成分分开即可。

当组成成分复杂干扰待测组分测定时，必须对样品进行纯化处理，或除去干扰组分或提取待测组分。尤其是生物样品的分析往往必须经过适当的预处理后才能分析待测组分。

2、色谱分离类型的选择 高效液相色谱法（以下检测HPLC）中色谱柱和流动相的选择必须依据标准品的性质。

3、溶剂的选择与处理 流动相溶剂要求纯度高；粘度小；对样品有适宜的溶解度；不引起注销损失且与检测器相匹配。使用前溶剂必须进行纯化和脱气处理。

HPLC分析时通常采用混合溶剂提高分离选择性。HPLC流动相系统中的PH值范围一般为2.5-7.5，因此溶剂系统往往采用低浓度的缓冲溶液，最常用的缓冲溶液时醋酸盐和磷酸盐缓冲液。由于该类缓冲液溶液易发霉，因此最好现用现配或置冰箱贮存。】

在分析复杂样品时可采用梯度洗脱方法，即按一定程度连续或间断改变流动相的组成使色谱分离效率提高，峰型改善，分析速度加快。

4、检测器的选择 在HPLC检测中，当样品有紫外吸收时，常选用紫外检测器。当样品本生或经过衍生化反应后能够产生荧光时常选用荧光检测器。电化学检测器使用于氧化还原性的物质检测。荧光或电化学检测器可使检测灵敏度提高2-3个数量级。

中国药典从1985年开始收载1HPLC方法，只有七个项目，全部用于含量测定；后来HPLC在药典中的收载项目不断增多，不仅用于含量测定，也用于鉴别和杂质检查等。1990年版药典收载中鉴别9项，杂质检测12项，含量测定达到55项；1995年版药典收载集聚增加，鉴别34项，检查48项，含量测定104项。

原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司