影响纸片扩散法药敏实验结果的因素及其常见误差的原因

影响纸片扩散法药敏实验结果的因素及其常见误差的原因

    1959年Kirby-Bower用试管法和纸片法检查 2000余株葡萄球菌，发现试管法测出的抗菌药物的MIC与纸片法测出的菌株环直径密切相关，并在此基础上制定捷世其结果的标准表。

1972年美国食品与药品管理委员（FDA）和国家临床实验室标准委员会（NCCIS）推荐纸片法扩散试验作为药敏的常规方法，主要用于需氧菌及生长快的兼性需氧管。

在纸片扩散的过程中，同时存在细菌生长和抗菌素扩散形成的梯度浓度两种力量之间的对抗，两种力量可收到不同因素的影响，必须认识这些因素，并加以控制，才能保证结果的正确。

影响纸片药敏试验结果的因素

1、培养基 应不含看菌药物及拮抗物质，蛋白胨中含氨基苯磺酸可使磺胺嘧啶中和，含叶酸代谢产物可使TMP作用时效。不含蛋白胨的牛肉浸液琼脂平皿可获得大二清晰的抑菌环，无胨牛肉浸液琼脂加入溶解的人血、马血或兔血则可使抑菌换更清晰。

对培养基的成分和盐类的浓度应保持相对稳定，不应任意改变，如绿脓杆菌对青大霉素的敏感试验受钙、镁离子的影响很大，Mueller-Hinton琼脂，基本上不含拮抗物质，食欲大多数病原菌生长。

培养基的厚度应为4mm，抑菌环薄大而厚小，平皿应放平浇注、平皿直径应为9-10cm，浇注培养基应为25毫升。琼脂的浓度一般应为1.3-1.7%核实，对抑菌环无影。PH应为7.2-7.4，偏酸偏碱对抗菌素的抑菌环物影响。培养基不应加单糖类以免产酸。培养基保存在2-3℃可用一周，成分浓缩，硬度增加等，均不利于细菌生长和扩散，培养基应等渗，对营养要求高的细菌，如链球菌、肺炎链球菌可加入5%羊、兔血等脱纤维血。

2、倍检菌种量的因素 是中药的影响因素之一。细菌接种量大，抑菌环小，菌量过少，抑菌环相对增大，Waterwrth建议，近融合、半融合生长为宜，被检菌稀释浓度的简易方法有三种；

(1)浸没法（Flooding法） 取菌落在2毫升蛋白胨水中制成悬液，加在另一支2毫升蛋白胨水中混匀，用滴管吸取菌浸没培养基，再将多余的菌悬液吸出。

（2）涂抹法（Barry 氏方法之一） 挑取被检菌菌落，转入无菌肉汤35-37℃培养4-6小时（或转大量菌悬液不孵育），菌液相当K-B浊度管0.5号浓度，肉眼比浊，菌液制备15分钟后用拭子浸沾菌液，将多余的菌液在试管上挤去，然后在平皿旋转60度角涂三次。

（3）重层法（Barry方法之二）挑取被检菌落4-5个转入0.5毫升脑心浸液肉汤中，于35-37℃，孵育4-5小时，达到/ml，可保持数小时稳定，用标准接种环，挑取1微升加入9毫升并冷至50℃的1.5%琼脂MH培养基中，充分混合，重层于已备好的直径15cm药敏试验用MH瓶培养基表面，若为9cm培养皿需含菌琼脂2毫升。

上诉各种发放均需开盖，室温无菌放置10-15分钟使水蒸发后贴纸片。

药敏纸片的因素

1、为对药敏实验的质量控制，应由检验中心统一制备纸片，用标准菌株做重复性实验，各纸片抑菌环直径相差不应＞1-1.5mm，纸片应含等量定量的药物，冷风吹干，不要在37℃温箱中烘干，以免有些青霉素敏感度下降。

2、纸片药物的含量对药敏结果的影响，纸片药物的含量是根据常规投药量和该药物的MIC来确定的，最是含量，能使不同敏感度的菌株抑菌环明显区分开，一般可按权威单位的推荐含量及出售厂商指定含量，根据MIC或服药后血清杀菌试剂或许晴含药浓度。

3、纸片保存不当的影响，一般保存一个月以上（密闭），可由不同程度的下降，低温干燥条件下4℃缸内保存时间长，取出后1小时贴上，开盖过早，空气中水蒸气进入收场音响药敏。

下图为粘质沙雷氏菌对青霉素G0.00020ug/ml敏感变化情况，在37℃培养实验中，80%相对温度条件下30天后，几乎完全失效。

（4）药敏纸片的贴附、孵育时间和判断时间不当对药敏实验的影响，在9cm平皿培养基上贴7张，纸片间距＞1.5cm，两片中心相聚＞24mm。贴后不移动，15分钟后放入35-37温箱中18-24小时判读结果。

     抑菌环一SIR为分界点，国内不论药物种类或被检菌相同与否，以抑菌环直径＞15mm为敏感（s），10-15mm中毒敏感（I)，＜10mm为耐药（R)。

除上述的各项影响因素进行质控，应严格遵守执行外，还要注意下列几个问题。

1、抗菌素的选择，应晒粮选定集中，按检查的菌种而取首选药物，如有耐药则另换，因为存在价差耐药为题，每类抗菌应选一种为代表，使临床医师有所了解。

2、纸片扩散使用于生长快的细菌，18-24小时孵育做终点读取结果，生长慢的细菌如甲型溶血性链球菌等应超过24小时观察结果。

3、报告方式；应报告敏感和耐药的抗菌药物，供临床医师选用，有敏感的抗菌药物，即不应宝中毒敏感的抗菌药物，中毒可做缓冲地带以减少药敏实验的误差。

4、纸片扩散一般应用平皿固体MH培养基，链球菌、肠球菌需加血，流感嗜血杆菌需用巧克力培养基。

5、不能再CO2环境中孵育，以免使琼脂表面PH受影响(PH降低）。

扩散试验误差的原因

实验条件和技术上的误差，对药敏实验的准确性影响很大，并且一种误差可能包含另一种误差，下面是遇到过的一些原因：

1、没使用MH培养基。

2、MH培养基制备不当，特别是PH调整不准。

3、使用过期和不当储存的培养基。

4、药敏纸片制作或保存不当。

5、菌液浓度不准。

6、比浊管制备和储存不当和过久。

7、接种时棉拭中过多的菌液没压出。

8、未及时将细菌接种于培养基平皿上。

9、接种后没及时贴附药敏纸片。

10、贴敷后没及时孵育。

11、唯独偏离35℃或大气中CO2含量过高。

12、时间不粗18-24小时，提前读取结果。

13、抑菌环量取不准确。

14、接种培养物使混合菌。

15、接种培养物使生长慢的细菌或厌氧菌，。

16、没有质控标准菌株对照。

17、没能正确的将被建军抑菌环转换为相应的S、I、R.

原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司