以DNA和RNA的体外操作为核心而建立的一系列旨在研究基因结构、基因表达及其调控的实验技术及相关理论，统称为分子生物学技术。其中最突出的是创立于20世纪70年代的DNA重组技术。这项技术已成为人类解码自身及生物界生命本质和主动改变生物遗传性状的有力工具，并以此衍生出不少新技术。
第一节DNA重组技术
DNA重组技术是运用多种限制性内切酪和DNA连接曲等，在细胞外将一种外源基因DNA(来自原核或真核生物)和或体DNA入连接重组．形成杂交DNA。再将杂交DNA转入宿主生物(如大肠杆菌)，使外源基因DNA在宿主生物细胞中随着生物细胞的繁殖而增殖或表达，最终获得外源基因的表达产物或改变生物原省的遗传性状。
这项技术是把DNA作为组件，按生物规律，人为设计来实现体外基因的改造，使生物的遗传性状获得改变，故称为“遗传工程”(genetic emgomeeomg)。基本质是基因的体外重组，所以又称“基因工程”(gene engineering)或“DNA重组技术”(recombinant DNA techniques）、“分子克隆”(mo1ecular cloning)等。
第一例DNA重组是1973年加利福尼亚大学的H.Boyer教授与斯坦福大学的S.Cohen教授
共同将pSC101质粒DNA与另一种抗卡那霉素的质粒DNA进行体外重组，杂交的DNA转人大肠杆菌，结果细菌表达出了双亲DNA的遗传信息，即同时抗四环索和抗卡那霉亲，说明外源基因得到了表达。DNA重组技术的成功说明：
①不同来源、无关的基因在实验室中可以按人的愿望进行重组构建。
②重组的外源基因引入另一种生物细胞后，可以保持其原有的遗传性状，在新的环境中被
增殖、转录和翻译，并可使宿注的遗传性状按照设计的路线发生永久性的改变。
长期以来，人类在认识和改变生物的遗传特性力面做了大量的研究工作，期待有一天能按人的意愿来改变生物的遗传性能，获得预想的结果。现在用DNA重组技术终于实现了这一意愿。这是20世纪生命科学上的重大进展．它促进了生命科学理论的发展，也对改善人类生活做出了重大的贡献。
这项技术既运用了前人的多项实验技术，包括DNA和RNA的分离制备、基因的分离、核
苷酸的顺序分析以及分子杂交方法等，同时也促进PCR技术、转基因技术、克隆技术及以定
点突变技术为基础的“蛋白质工程”等新技术的产生。可以说，DNA重组技术深入到生物科学
的方方面面，成为当今生物科学工作者必备的基本知识与技能。
一、DNA重组技术的基础
DNA重组技术的出现不是偶然的，是前人多项实验技术积累的结果。
1．核酸的制备
20世纪60年代以来，生物化学实验技术包括电泳、层析、电镜、同位素和超离心等技术及仪器设备的不断发展与创新，为DNA重组技术的产生提供了重要的手段。DNA和RNA的分离制备就是一个例子。20世纪40年代以前，要想从生活的细胞中制备出比较完整的DNA和RNA供体外研究是很困难的，因为缺乏必要的手段来防止DNA制备过程中脱氧核糖核酸酶(DNase)的阵解作用及操作中剪切力的破坏。在找到柠檬酸、EDTA等金属络合剂和十二烷基硫酸钠(SDS)、酚、尿素、焦碳酸二乙酪等蛋白变性剂之后，这些试剂有力地抑制了DNase的活力；另
外，低温高速离心机以及新的层析方法的运用，使制备分子比较完整的DNA成为可能。现在已能从动物组织、植物组织、细菌及病毒巾制得比较完整的DNA分子。然而，在制备过程中由于操作、振荡等产生的剪切力对DNA，尤其是高等生物的染色体基因组DNA分子仍有破坏作用，使共总会遭到剪切，故获得完整的DNA分子仍是不容易的。
RNA的分子比DNA小，极易遭到核糖核酸酶(RNsae)的降解。RNase十分稳定，不易被
破坏，且具有惊人的活力，如加热至蛋白质变性的温度(90℃）其活力也不完全丧失。RNase分布极广，不仅存在于细胞内也分布在环境中，包括于和器皿上。如不小心，RNA极易被降解。近年来经过技术改进．已经能制得各种RNA，尤其是mRNA。
一般讲，从细胞中获得的DNA、RNA纯品，其化学性质是稳定的，只要贮存条件得当，可以保存很长时间。这为DNA、RNA在体外进行各种研究提供了可能性。
此外，核醒含量的测定、同位素标记、分子杂交以及DNA和RNA的核苷酸顺序测定等技术的产生与发展．为在体外分析和鉴定核酸提供了重要的检测手段。
2．限制性内切酶
DNA重组是指在实验室将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程。这一步是在限制性内切酶发现以后才实现的。
20世纪50午代，有人在实验中曾经发现同一种噬茵体分别与两种细卤培养，噬茵体只在一种细菌中成活，而杯另一种中绝大多数不能成活，这表明这个菌株对入侵的噬菌体具有限制性用。1962年、Arber等人经过多次实验终于证明：细菌中存在有两种酶，一种是限制性内切酶，可以将外源DNA切割降解；另一种是修饰酶也称甲基化酶，能使DNA中的核苷酸甲基化，使之不受限制性酶的降解。两种酶可对同一DNA序列作用。细菌借助这两种酶，将自身的DNA进行甲基化修饰使之不受限制性内切酶的降解，而对外来的、未甲基化的DNA则进行降解，以保认细菌自身的DNA不受外来DNA的干扰，保持其遗传性状的稳定性。这两种酶在体内组成一个系统，称限制／修饰系统(restriction-modification system)。
以后从细菌中分别分离出了I型和II型两类限制性内切酶。I型能识别DNA分子内非甲基化的特定序列，但切割是随机的．见切割位点远离识别位点，不能生成特定片段。II型是1970年Smith第一次从流感嗜血杆菌中分离到的，它能识别双链DNA分子中特定的序列，大部分具有二倍对称性(回文结构)。
对称轴位于中间AT碱基对之间，箭头和星号分别表示酶切位置及甲基化位置。II型限制性内切酶识别的DNA序列一般长度4、5和6个碱基对。限制性内切酶切割DYA的方式有：
1、从识别序列的中间切开，产生平齐末端(blunt ends)。如HaeIII。
2、在识别序列对称轴的左边(3′→5′链)和右边(3′→5′链)进行切割，形成带有凸出的；—磷酸苯闭的戳件人端(cohesivend)。
3、介识别序列对称独的右边(5’一3’链)和对称轴左边(3’—k5’链)切开，形成带有凸出的3′-羟基的黏性末端(c)。
黏性末端只要用同一个酶切割的DNA片段退火即可连接，因为黏性末端互补的。平齐末端则需要另一DNA片段也修饰成平齐末端方可连接。
已知的限制性内切酶已达千余种。在了解各种限制性内切酶“切割”特点的基础上．巧妙利用互相的关系，即可将DHA分子按人的愿望切剖成人小不同的片段，供DNA重组运用。限制性内切酶有如一把“生物于术刀”，为DNA重组技术提供了有力的工具。
限制性内切酶都来自各种细茵，它们的命名是用细菌属名的第一个字母〔大写)和种名的前两个字母(小写)构成酶的基本名称。若酶是从—种特殊菌株来的，在基本名称后再加上该菌株的名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如Hae II是从(H aernophilus aegypticus)中提取的，并且是从中发现的第二个酶。
限制性内切酶切割成的DNA片段，重组链接时由DNA链接酶催化进行。
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