分光光度法 50 管/48 样
测定意义：
Pro 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内 Pro 含量显著增 加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此， 脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。
测定原理：
用磺基水杨酸（SA）提取 Pro，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯 萃取后，在 520nm 测定吸光度。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、 甲苯 50mL、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：冰乙酸 25 mL×1 瓶， 4℃保存。（自备） 试剂二：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存。
试剂三：甲苯 50mL×1 瓶，4℃保存。（自备）
样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液）， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；之后 置沸水浴振荡提取 10min；10000g，常温离心 10min，取上清，冷却后待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加 入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取 10min；10000g，常温离心 10min， 取上清，冷却后待测。
2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建 议取 0.1mL 血清（浆）加入 1mL 提取液），充分混匀，之后置沸水浴振荡提取 10 分钟，10000g， 常温离心 10 分钟，取上清，冷却后待测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 520nm，蒸馏水调零。 2、样本测定：
(1)取 0.5mL 样本+0.5mL 试剂一+0.5mL 试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温 30min（盖
紧，防止水分散失），每 10min 振荡一次。
(2)待冷却后，在试管中加入 1mL 试剂三，振荡 30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸 取 0.8mL-1mL 上层溶液于 1mL 玻璃比色皿中，于 520nm 波长处比色，记录吸光值 A。
Pro 含量计算：
1、典型回归方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 为脯氨酸含量，μg/mL；y 为吸光值 A) 2、按照血清（浆）体积计算
Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021) 3、按照蛋白浓度计算
Pro 含(μg/mgprot)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr 4、按照样本质量计算
Pro 含量(µg/g 重)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021)÷W 5、按照细菌或细胞密度计算
Pro 含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021) V1：加入反应体系中样本体积，0.5mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆） 体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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