ELISA 试剂盒的组成
在酶联免疫吸附法中3个必要的条件，就是已经包被过的板，酶结合物和底物，ELISA还需要包被抗原或抗体的微孔板、阳性对照物、阴性对照物、酶结合物、底物及标本的稀释液和反应终止液等试剂。所使用的材料主要指固相载体-微孔板。
一 固相载体
可作为ELISA固相载体的物质很多，例如聚乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、玻璃和硅橡胶等、但现已不多用。理想的ELISA板应该是吸附性能好、空白值低、透明度高、隔空的大小和性能相同。目前最常用的是聚苯乙烯、他有较强的吸附蛋白质的性能、并且不损害蛋白质的免疫活性，不行影响ELISA过程中的免疫反应和显色反应，价格低廉，来源容易，因此被普遍采用
二 固相载体的特征
ELISA再提的形状主要有3种：微量滴定板、小珠、小试管。以微量滴定板为常用，专用ELISA的产品成为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8*12的96孔式。为便于做少量标本的检测有制成8连孔条12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板特显是可以同时进行大量标本的检测，并可以在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定版型的ELISA检测。包括加样、洗涤、保温、比色步骤，对操作的标准化纪委有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸收性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使股向上抗体量增多，但用于间接法测定抗体时空白值较大良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，隔板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品质量差异较大，因此每一批号的ELISA板在使用前需要事先检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读书的均读数之差，应小于10%。
余聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体聚氯乙烯的特点是质软板薄，可剪切，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白的吸附性能比聚苯乙烯高但空白值液略高。
为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可应用如下的实验，用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将他们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上预订的ELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别大，这种载体就是这一ELISA测定项目中最合适的固相载体。、
在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径为0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。吸附面积的增大意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球形小珠的表面弧度更有利于媳妇的抗原决定粗或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状体，因此珠式ELISA的放映往往更为灵敏。小珠的另一特点是更容易洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好，但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试管敏感性的提高。小试管还可以做比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成颗粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积较大，反映在悬浮中进行，其速率与液相反应近似。以寒铁的磁性颗粒为ELISA固相载体，反应后磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。
三 包被的方式
将抗原或抗体固定的过程叫包被。换言之，包被既是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子机构上疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，蛋白质的分子量、等电点、浓度等影响。载体对不同蛋白质的媳妇是非特异性的，受蛋白质的分子量等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，更容易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等故乡具有较强的吸附能力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴漏于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多可以采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴漏，在这种情况下，直接宝贝效果不佳，可以采用间接的补货包被法，即先将针对该抗原的特异抗体做预包被，气候通过抗原抗体放映使抗原固相化。此间接结合在股向上的抗原原理载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴漏。间接宝贝的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质量较多的抗原也可采用补货包被法，实验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，因为直接包被的1/10甚至更少。不易吸付在聚苯乙烯载体上的份蛋白质抗原可采用特殊的包被方式，例如在检测抗DNA抗体时，需要DNA作为包被抗原，而普通的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经过紫外线照射，以增加其吸附性能。固相载体先用先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等做预包被，也可提高核酸的结合能力。液作用亲和素系统做间接宝贝，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种方法均匀，牢固，以扩大大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置于冰箱过夜或冷风吹干，带酒精挥发后，让脂类自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式
四 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按来源分为天然抗原，重组抗原和合成多肽抗原3大类
天然抗原可曲子动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能做包被用。如HB-sAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成分抗原可从富含此抗原的材料中提取
重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为智力题。重组抗原的优点是除工程菌成分外，其他杂质少，而且无传染性，单纯化技术难度较大。一大肠杆菌为智力题的重组抗原如不能充分去除大肠杆菌成分，用于ELISA，在反应中可出现假阳性。因不少受检着受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中作用宝贝抗原大多为根据HCV的基因可控表达而制备的重组抗体。在传染病诊断中，不少重组抗原HBsAg、HBeAg、HIV抗原均在ELISA中取得应用。
合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的莫伊抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。脱胎抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高。但由于分子量太小，往往难于直接洗孵育固相上。多肽抗原的包被一般需要先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白至等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，简介的结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为它仅能检测语气相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体昌盛的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原放生反应。另外，默写微生物发生变异时往往发生抗原结构的变化，在这种情况下用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗原的漏检。
五 包被用抗体
包被固相载体的的抗体应具有较高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单可克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质.在抗徐庆忠将出现杂抗体，必须去除后才能用ELISA，以保证实验的特异性。抗血清不能直接用于包被，影响提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和SEPHADEX凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析出提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性能不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高实验的敏感性，则可采用亲和层析法一出去康徐庆忠含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性较强，因此不需要做吸收和亲和层析处理。一般讲腹水做适当稀释后直接宝贝，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某种情况下，用多种抗单混合包被，可取得更好效果。
六 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度、包被的温度和时间、包被液的PH值等应根据实验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也用ph值为7.2的梨酸盐缓冲液通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8摄氏度冰箱中放置过夜，37℃中保存2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ul/ml
七 封闭
封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液在宝贝的过程。抗原或抗体包被时所用浓度较低，吸收后固相载体表面尚有违背占据的空隙，封闭就是 让大量不想关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%明教作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大特点是价廉，可以高浓度使用。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当做封闭剂使用，但由于奶粉的成分复杂，而且封闭后载体不易长期保存次芳芳较少应用。
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需要封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高，一般来说，双抗夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是单抗腹水直接包被时。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
技术支持:阿仪网
