ELISA试剂盒使用中酶结合过程
酶结合物即酶标记物（或抗原）,是ELISA中最关键的试剂。良好的酶结合物应该是既有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应精良不含有货不含有游离的（未结合的）酶活游离的抗体（或抗原）.此外，酶结合物尚要有良好的稳定性。
酶
用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留他的活性部分和催化能力。最好在受检标本易于测定等。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 和践行磷酸酶 在少数商品ELISA中应用酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等、
国产ELISA试剂盒中一般采用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%分子量为44000KD，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁红蛋白素）结合而成，是一种卟啉蛋白质，主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ标示，是403nm的吸收度与280nm吸光度之比。高纯度的HRP的RZ大于等于3.0
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较为稳定的等特定，值得注意的是，在选用酶制剂时，处其纯度外，跟应该注意没的活力。高纯度的酶如果保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位标示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。
抗原和抗体
制备结合物时采用抗体一般为纯度较高的IgG，以免在酶联结室其他杂蛋白干扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特意的免疫活性，可以再高稀释度进行反应，实验结果本底干净。如果F（ab)2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的
ELISA-酶结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种：戊二醛交联法和国电酸盐氧化法。
戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，他可以使酶与蛋白质氨基酸通过它二链接。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法分一步走两步走两种。在一部法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后记得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般用此法交联。它具有操作简便，有效和重复性好的优点。缺点是交联反应时随机的。酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有坑内交联，影响效果，在两步法中，先将酶与戊二醛作用，在于酶酶结合。两步法的产额不中绝大部分的酶与蛋白质是1:1的比例结合。较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高灵敏度但其偶联的有效率较一步法差。
ELISA-酶结合物的保存
没变抗体中酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存1年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不变。结合物溶液中加入灯体的甘油可在低温冰箱或普通冰箱中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配制稀释液，临用时按表明的稀释度稀释成工作液。现在先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作也，使用时不需再行稀释，在4-8摄氏度保存期长达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活。需要加入蛋白保护剂，联外加入抗生素和防腐剂以防止细菌声场。
ELISA-酶结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物一赔成工作也。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质，通常竞争抑制结合物的吸附，一般还加入具有抑制蛋白吸附于塑料表面的非离子型活性剂。如图为-20 ，0.5%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本须稀释后惊醒测定，也可应用这种稀释液
ELISA-酶的底物
HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应，应最具代表性的过氧化物为H2O2其反应式如下
DH2+H2O2→D+2H2O
上式中，DH2wei 供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中DH2一般为无色化合物，经酶作用后生成有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体为邻苯二胺、四甲基联苯胺、ABTS。OPD本身难溶于水，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式。片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过啊氧化氢则胚乳底物缓冲液中，有支撑一曹村的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。陷阱的万里沙试剂盒中则直接配成含宝贝虎剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液，只需加入OPD即可作为底物应用液。TMB经HRP作用后共产物显蓝色，木事对比鲜明。TMB性质稳定可配成溶液试剂。只需与H2O2溶液混合既成应用液，可直接做底物使用。另外,TMB无致癌性等优点，因此ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL和H2SO4终止后，TMBA产物有蓝色呈黄色，可在比色中定量，最适吸收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些实际和所采用。
另一种HRP的底物为3-（4-羟基）苯丙酸经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA有点味可加宽定量测定的线性范围
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分子醇的过氧化物和尿素过氧化物。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便，稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭，低温（2--8℃）可稳定1年。
AP的底物
AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基苯分，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮）,可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于显色底物的比色法。
ELISA洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为磷酸缓冲液或Tris-HCL缓冲液，加入0.05%Tween-20可加强去除非特异性反应的作用。一些洗涤仪器设计有特殊的冲洗装置，用蒸馏水做洗涤液，同样有彻底洗涤的效果。
ELISA终止液
常用HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在办事ELISA中一般采用2mol/L
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也做为判断结果的对照，因此对照品，特备是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清因为正常人许晴在跟中ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血清较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料，记载血浆中加入钙离子，十七中的纤维蛋白质凝固，出去凝块后所得的液体，其组成与血清相同
阴性对照品现行检测，去顶其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,UI好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基础，其中加入一定量的待检物质。加入的量英语试剂敏感度相称，在代测中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有个粗略的估计。
代测样品：
可用作ELISA测定的标本十分广泛，血清、血浆或其他体液均可作为酶免疫测定法中使用的大侧标本，代测标本的质量液影响最后的测定结果。标本中蛋白质浓度过高会产生非特异性吸附干扰固相包被，而过分稀释的血清或血浆会影响抗原-抗体之间的免疫学反应，标本中可能存在的内源性过氧化物酶会干扰显色反应等，客服或减少这些问题的最简单拌饭Shiite采用适当的稀释办法，再去定包被液浓度、酶结合物浓度及孵育时间后，将达侧血清标本不同程度的稀释后按elisa生产工艺操作，比较血清各稀释度反应后测得吸光度值，一般去值为1.0时稀释度为宜。然而稀释法虽然可减少样品中的蛋白质或其他成分火谷乡菲特西行结合及降低底物反应式的非特异性显示程度，但也可能降低酶免疫法的检测的敏感性。
人血清中的自身抗体成分，特别是类风湿因子对双抗体夹心法次顶有一定影响。是造成假阳性反应的原因之一，测定HBsAg或甲胎蛋白时常出现假阳性结果。因此HBsAg筛选实验阳性者还要用抗-HBs中和后做确诊实验，测AFP时则在标本中先用已加热聚合的人IgG与可能存在的类风湿因子反应，已消除类风湿因子的干扰作用。保存的血清标本切忌反复冻融，以免降低血清中的抗体或抗原的免疫活性。分离血清最好是让血液在室温中放置一定时间，使其自然凝固后将许晴析出，血液标本不宜置于4℃下凝固，以防丢失大量的IgM及部分IgO.
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